气相色谱仪操作要点与维护及故障排-第3章
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⑵Sephadex LH…20，是─Sephadex G…25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：
商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio…Gel…A（美国Bio…Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4…9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：
是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，
由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P
（Bio…Gel P），由美国Bio…Rod厂生产，型号很多，从P…2至P…300共10种，P
后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构，
可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
三、实验技术
（一）层析柱
层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，
直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20…30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4…10倍。
分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。
（二）凝胶的选择 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex
G…20的吸水量为20，1 克Sephadex
G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100…200号筛目的的Sephadex
G…200效果好， 脱盐用Sephadex G…25、G…50，用粗粒，短柱，流速快。
（三）凝胶的制备
商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1…2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，
自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。
（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex
G…15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1…4％（一般约0。5…2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20…30％。
分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。
（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：
⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0。02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。
⑵可乐酮＇Cl3C…C（OH）（CH3）2＇在凝胶层析中使用浓度为0。01…0。02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。
⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0。05…0。 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。
⑷苯基汞代盐
在凝胶层析中使用浓度为0。001…0。01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
feeling1356 2007…6…30 8：38：00
亲和色谱法
一、基本理论
（一）原理
在生物体内，许多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲色谱法。亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。亲和色谱法的基本过程是：
1。配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。
2。亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。
3。解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。
（二）应用范围
亲和色谱可用于下列生物体系：
酶：底物、抑制剂、辅酶
抗体：抗原、病毒、细胞
外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体、
细胞核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白
激素及维生素：受体、载体蛋白
细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素
亲和色谱的优点是操作简便、效率高、条件温和，缺点是使用局限性大。
（三）载体的选择原则
用于亲和色谱的理想载体应具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过；⑶有一定硬度，最好为均一的珠状；⑷具有大量可供反应的化学基团，能与大量配基共价连接；⑸非特异性吸附能力极低；⑹能抗微生物和酶的侵蚀；⑺有较好的化学稳定性；⑻亲水性。选择配基根据对纯化大分子的特异性的全面认识。
选择也的配基有两条标准：
第一是蛋白质和配基之间必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好配基；
相反亲和力太高也是有害的，因为在解离蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生物素蛋白复合物的解离常数达10…15M，解离时需要pH1。5，6M盐酸胍，在这种条件中。羧化酶大多数已经变性。
选择配基的第二个标准是，配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结合，但可用于活化和载体相连接，同时又不影响配基与蛋白质之间的亲和力。
（四）常见载体的特性
琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose）
聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。
葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。
纤维素： 非特易吸附严重，廉价，易得。
二、实验方法
亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同而有不同。一般推荐使用的程序如下：
1选 择 配 基；2选择偶联凝胶；3偶 联 配 基；4装填合适的柱；5平衡（2…3倍体积缓冲液）；6应 用 样
品；7洗涤未结合物质；8洗脱结合物质→除盐；9再生
高压液相色谱
Martin 和
Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展，高效液相色谱才付诸实现。这种色谱技术曾被称为高速液相色谱（HighSpeed
Liquid Chromatography），高压液相色谱（High Parss…ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名称是高效液相色谱（High Pe…rformance Liauid
Chromatography，HPLC）。高效液相色谱已经广泛地应用，成为一项不可缺少的技术。它的主要优点是⑴分辩率高于其它色谱法；⑵速度快，十几分钟到几十分钟可完成；⑶重复性高；⑷高效相色谱柱可反复使用；⑸自动化操作，分析精确度高。根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂
feeling1356 2007…6…30 8：39：00
一、分类
高效液相色谱法可分为四个基本类型：即液－固色谱法，键合相色谱法，离子交换色谱法及体积排阻色谱法。
（一）液－固色谱法
液－固色谱法通常称吸附色谱法，吸附剂有活性碳，氧化铝和硅胶，在液－固色谱法中用的载体都是硅胶。硅胶对溶质，分子的吸附能力不是平均分布在整个硅脱表面的，在硅胶表面有一些区域与溶质分子强烈相互作用，这些区域为活性位置，硅胶与溶质分子间主要作用是偶极距力氢键及静电相互作用。极性越强，而化合物在硅胶柱上的滞留时间也长。在液－固色谱中，依靠流动相溶剂分子与溶质分子竞争固定相互活性位置，
从而使溶质从色谱柱上洗脱下来。与硅胶表面活性位置结合力强的溶剂洗脱溶质分子的能力强，因而称强溶剂，反之为弱溶剂。液─固色谱法的特点是适于分离色谱几何异构体，可用于脂溶性化合物质如磷脂，甾体化合物，脂溶性维生素，前列腺素等。
（二）键合相色谱法
键合相色谱法是由液－液色谱法即分配色谱发展起来的。键合相色谱法将固定相共价结合在载体颗粒上，克服了分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。键合相色谱法可分为正常相色谱法和反相色谱法。
1。正常相色谱法
在正常相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团，如一级氨基、氰基、二醇基、二甲氨�
