trizol法同时提取rna,dna,蛋白质-第1章

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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　TRIzol法同时提取RNA；DNA；蛋白质

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用；与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。　
TRIzol试剂可用于小量样品（50…100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、》107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern　Blot，dot　blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT…PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western　Blotting。　
规格：100ml　黄色透明液体　
储存条件：2…8℃避光保存12个月　
注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。　
预防RNase污染注意事项：　
1。经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。　
2。使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。　
3。RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0。5M　NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。　
4。配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0。01℅v/v；放置过夜；高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）

RNA的提取　
准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0。5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）　
操作步骤：　
1。　匀浆处理：a。组织　将组织在液氮中磨碎；每50…100mg组织加入1ml　TRIzol；用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。　
b。单层培养细胞　直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3。5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。　
c．细胞悬液　离心收集细胞，每5…10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml　TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。　
2．将匀浆样品在室温（15…30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。　
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2…8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。　
5。　每使用1ml　TRIzol加入0。2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。　
6。　2…8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。　
7。　把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml　TRIzol加入0。5ml异丙醇，室温放置10分钟。　

　

　

8。　2…8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。　
9。　用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml　TRIzol至少加1ml　75℅乙醇。2…8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。　
10。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5…10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25…200μl无RNase的水或0。5℅SDS；用枪头吸打几次；55…60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应；勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，…70℃保存。　
注意事项：　
1。从少量样品（1…10mg组织或102…104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml　TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5…10μg　RNase…free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。　
2．匀浆后加氯仿之前样品可以在…60至…70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75％　酒精中2…8℃一星期以上或…5至…20℃一年以上。　
3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30…60分钟。　
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：　
肝和脾6…10μg　；肾3…4μg　；骨骼肌和脑组织1…1。5μg　；胎盘1…4μg　；上皮细胞8…15μg　；成纤维细胞5…7μg　。　
常见问题分析：　
得率低：A。样品裂解或匀浆处理不彻底　
B．RNA沉淀未完全溶解　
A260/A28012000×g离心10分钟除去。　

　

　

DNA的定量：取一份溶于8mM　NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7。1μg　；　6。5μg　；　5。8μg　。　
预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3…4μg　骨骼肌，脑组织，胎盘2…3μg　人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5…7μg　成纤维细胞5…7μg　
应用：1。用于PCR　溶于8mM　NaOH的DNA用0。1M　HEPES调pH至8。4；取0。1…1μg　DNA用作模板。　
2。酶切反应　用HEPES或1mM　EDTA调节pH至适当值。每μg　DNA使用3…5单位的酶，80…90％的DNA是可消化的。　
1ml　8mM　NaOH溶解的DNA样品pH值调节　
Final　pH　0。1M　HEPES（μl）　Final　pH　1M　HEPES（μl）　
8。4　86　7。2　23　
8。2　93　7。0　32　
8。0　101　
7。8　117　
7。5　159　
注意事项：　
1。　DNA在中间层和有机相中时可在2…8℃保存过夜。　
2．DNA沉淀在75％乙醇中2…8℃可保存几个月。　
3．DNA在8mM　NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7…8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或…20℃长期保存。　
常见问题分析：　
得率低：A。样品匀浆和裂解的不彻底　
B．最终得到的DNA沉淀没有完全溶解　
A260/A280