pcr反应常见问题汇总-第2章

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　　模板（靶基因）核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：　溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS　还能与蛋白质结合而沉淀；　蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2＋浓度　Mg2＋对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2＋浓度为1。5～2。0mmol/L为宜。Mg2＋浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq　DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

9。PCR反应条件的选择
　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
　　温度与时间的设置：　基于PCR原理三步骤而设置变性…退火…延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40　～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq　DNA　聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，　除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq　DNA酶仍有较高的催化活性）。
　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
　　②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA　比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G＋C含量约50％的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
　　　　　Tm值（解链温度）=4（G＋C）＋2（A＋T）
　　　　　复性温度=Tm值…（5～10℃）
　　在Tm值允许范围内，　选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，　提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
　　③延伸温度与时间：Taq　DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　70～80℃　150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　70℃　60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　55℃　24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　高于90℃时，　DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够　的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。