实验室手册-第5章
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双蒸水至1000ml；10P’；10’灭菌；4℃保存；可用3个月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0。25％
取0。25克溶于100mlHank’s滤过除菌；分装小瓶。…20℃保存。用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5。6％NaHCO3滴定至PH7。4…7。6
注意：
1． 为避免消化细胞成团，可配无钙胰酶液．
2． 胰酶威无臭无味的白色粉末，应密封保存，阴暗处防潮解，可分装小瓶保存．
3． 胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定．一般消化配组织用0。1％。
六。碳酸氢钠液
取NaHCO35。6克溶于100ml双蒸水中；使完全溶解后；经滤纸过滤后；分装于瓶中（5ml或2ml）10P；10’灭菌。塞紧胶塞；贴上标签；注明批号日期；4度保存备用。（在4度应为透明液；不得有沉淀）。每瓶开启后使用不得超过2次。
七。0。5％乳蛋白水解叶（LAH）
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中；根据需要分装50…100ml瓶；立即10P；20’灭菌；4度保存备用；用前；用5。6％ NaHCO3滴定PH7。4…7。5。
注：乳蛋白水解物极易潮解；平时必须将瓶塞紧；最好储存于干燥器中；乳蛋白水解物含有丰富的营养成分。0。5％乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清；即可用于一般的细胞培养。
（一）。CEF培养
0。5％LAH
CS 5％
Pen 100unit
Str 100ug/ml
5。6％ NaHCO3调PH至7。2…7。4
（二）PK细胞培养
0。5％LAH 89。5％
CS 10％
Pen/Str 100unit/100ug/ml
八。Earle’s液
甲液：NaCL 68g
KCL 4g
NaH2PO4 1。4g
葡萄糖 10g
双蒸水至500ml；溶解后加氯仿1ml防腐
乙液：CaCL2 2。0g
MgCL2 1。7g
0。4％酚红50ml
双蒸水加至500ml；0…4度保存备用；按比例配成Earle’s液。
甲 1V 10P 10’灭菌
乙 1V 10P 10’灭菌
双蒸水 10V 10P 10’灭菌
4度保存备用；用前用5。6％ NaHCO3调PH至7。4…7。5
九。抗菌素溶液（Pen/Str）
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen（青霉素）10；000units
Str（链霉素）10；000ug
分装小瓶；…20度保存。一般培养液加这种Pen/Str％；最终浓度为100unit/ml。
十、199—F10生长液
199 5。49g（4。95g）
F10 4。9g
NaHCO3 1。7g
S。P 1ml（10万U/ml）
BFS 40ml
DDW 至1000 ml
过滤后分装备用。
199…F10维持液：BFS仅用10ml；余者同上
第三节 配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A。R。级；标签清楚；最好组织培养专用；防止使用和保存过程中的混淆和污染。
2。配制溶液的用具；需经严格洗刷和消毒；其配制过程尽量在无菌操作下进行。
3。称量药品应力求精确。配制溶液应有详细记录以及消毒，保存；分装和使用情况。
4。配制的每批溶液；需经试用后；方可大量使用。因此需提前配制溶液。溶液保存有一定期限；保存时应经常检查；发现可疑现象和过期；不得使用。
5。注意节约；计划用多少就配多少。
第二章 淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节 融合程序
融合方法：
1、 将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、 1000r/m离心5分钟；
3、 吸净全部培养液；
4、 在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、 用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50％PEG（PH8。0）1ml，边加边搅；
6、 用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、 1000r/m5分钟；
8、 弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、 按比例加入107 —2X77 腹腔细胞（约2只小鼠）；
10、 分装96孔细胞培养板，每孔0。10__0。15ml；24孔板，每孔1。0__1。5ml；
11、 7。5％CO2；37℃孵箱里培养；
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液；
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT；
14、 经常观察杂交瘤细胞生长情况；待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
15、 其它详细资料请参阅刘秀梵教授编。
第二节 溶液配方
一、 基础培养液：
1、老配方 DMEM 13。37g＋1000ml双蒸水使之溶解
丙铜酸钠 0。11g
碳酸氢钠 3。6g
pen/str 20万/2
0． 22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
2、新配方 DMEM基础液：
四蒸水 980ml NaHCO3 3。7g
DME（Giboo） 13。37g S。P（100X）10ml（本实验室用1支庆大霉素）
1NHCl调试PH至7。2_7。4（本实验室用1NnaOH调至7。2_7。4）；过滤除菌；分装后4℃保存。
3、 DMEM完全培养基：
30mlDMEM基础液中加15…20ml BFS，1mlL…G（100X）即为完全培养基。
4、 HT培养基
100mlDMEM完全培养基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
四蒸水 980ml
DME（Giboo） 13。37g L。G（100X） 10ml
HT（100X） 10ml BFS（NCS） 150_200ml
NaHCO3 3。7g S。P（100X） 100ml
用1NHCl调至7。2_7。4； 过滤除菌；分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（…5）M MW=440。4）
1。76mg A＋90ml双蒸水＋0。5ml 1N NaOH助溶，双蒸水加至100ml＋0。5ml 1N HCl中和；0。22um滤膜过滤除菌；分装2ml小瓶；…20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（…5）M solution
Thymidine： MW242。2 1。6X10（…1）M solution
H和T可以配在一起，136。1mgH＋100ml双蒸水＋1N NaOH至H溶解；加T38。8mg；把PH用醋酸调至9。5； 0。22um滤膜过滤除菌；…20℃保存。
四、 100Xglutamine 200Mm Solution
2．92g glutamine
100mlDMEM基础液，；37℃助溶液
0。22um滤膜过滤除菌；分装2…5ml小瓶，…20℃保存。
五、融合剂配制：PEG（Baker 1000）20…50g于三角瓶中，盖紧，60…80℃水浴融化，0。6ml分装于青链霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌，…20℃保存备用。临用前加热融化，加等量DMEM基础液，用少许5。6％NaHCO3调PH至8。0。
第三节 单抗制备技术中的其它方法
一、杂交瘤细胞的克隆化
1、 制备小鼠腹腔细胞；
2、 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液；用不着5…20％血清的HT培养基稀释后使每毫升含2。5、15、50个细胞3种不同的稀释度。
3、 按每毫升加入5X10（4）…5X10（5）个细胞的比划，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔细胞；
4、 每种杂交瘤细胞分装货6孔板一块，每个稀释度32孔，每孔的量为0。2ml，每孔的杂交瘤细胞分别为0。5、3、10。（或将士、3、4步改为配制15毫升HT培养基中含100个细胞，加入腹腔细胞后分装96孔1块）；
5、 37℃，7。5％CO2湿润培养基7—10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；
6、 在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
7、 取阳性的细胞扩大培养，并冻存。
二、 细胞冻存和复苏方法
1、 将对数生长期的杂交瘤细胞或其它细胞 离心，重新悬浮于预冷的冻存液中（其中含10—20％小牛血清，10％DMOS的HT培养基），浓度至少5X10（6）/ml。
2、 分装安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、 封口后，将发瓶入入一带收口绳的小布袋内，立即将布袋放入内衬石棉的百铁筒内，置—70℃冰箱。
4、 2—4小时后，或过夜后，将布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存时间不宜过长，一般不超过24小时。
5、 复苏细胞时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一点冰快要融化时，从冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培养基稀释，离心后，再悬浮于适量培养基中，装瓶，置37℃含7。5％CO2培养箱中培养。
6、 如细胞存活率不高，可加腹腔细胞 进行培养。
7、 细胞 存取均应为高，可加腹腔细胞进行培养。
8、 细胞存取均应做好记录。
三、 单抗的大量生产
1、 腹腔接种降植烷（Pristane）或液体石腊，每只小鼠（2月龄以上）0。5ml。
2、7—10天后腹腔接种PBS稀释的杂交瘤细胞，每只鼠5X10（5）/ml0。2ml。
注意：每只鼠接种细胞 数不可太多或太少，否则单抗菌素产量不高。
3间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨起，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。
5、 离心，去除细胞 成份和其它沉淀物，测定抗体效价，可加防腐剂（0。01％硫柳汞或者说％叠氮钠）小量分装；—70℃保存。
第三章组织培养使用物品的准备
1、 器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、 分类洗涤、处理是必要的，不妨可分为不与细胞直接接触的器材和与细胞 直接触的器材，它的洗刷条例不尽一致；
3、 厉行节约，可以重复使用的器材不应废弃；
4、 需要特殊处理的器材，如病原材料污染的器材物品，须协助洗涤人员作无害化处理；
5、 高压消毒或高温干烤器械时，务必有人在场。
第二节 玻璃器皿的准备
1、 规格：组织培养用的玻璃器皿要求严格，以中性硬质玻璃为适宜，用于培养细胞 的培养瓶更应注意选择，一般常用的细胞 培养瓶有链霉素瓶，方形、园形克氏瓶等。蜕2瓶的接种面应平坦，瓶口内径力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏气。其它培养中弯头吸管、试管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、 洗涤
用过的玻璃器皿，先用清水冲洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干净，浸泡于洗涤液中1—2日，取出后自来水冲洗7次，再用双蒸水或去离子水三盆，分盆冲洗5次，并在双蒸水或去离子水中浸泡过夜，晾干或烘干，包装消毒。新购置的玻璃器皿在25％的浓H2SO4或3％的稀盐酸中浸泡过夜，再进行以上洗涤、晾干、包装、消毒。
3、 包装、消毒
小培养瓶或链霉素瓶可放在普通铝制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金属筒中消毒。盐水瓶用牛皮纸包口后，160℃2小时，干热灭菌。
第三节 橡皮朔料制品的准备
1、 规格：
选用质软能耐高压，对细胞 毒性小的橡皮塑料制品。
2、 洗涤：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1％NaOH中煮沸30分钟，然后用自来水冲洗5—7次，用双蒸水冲洗3次，再用双蒸水浸泡过夜色。用过的橡皮塞洗净后，以双蒸水煮沸30分钟，晾干，包装消毒。
3、 包装灭菌：
将洗涤、晾干的橡皮塞放在小铝盒内或培养皿内。其它橡皮制品用纸包好，15P20—30分钟。
第四节 其它用品的准备
一、 滤过用布：指麻布或娟布，剪成小块，浸于丙酮中，在�
