实验室手册-第15章
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（2） 用脾、肾、淋巴结、扁桃体等脏器中的一种在载片上作两个横切触面，自然干燥。
（3） 对两张片子作正反、左右标记。
２、 固定
将玻片置染色缸中，用4℃丙酮固定10分钟。
３、 灭活内源酶
取内源酶灭活液100ml于待检玻片的染色中，室温灭活30分钟，将玻片取出，流动的PBS洗15分钟，再换去离子水洗10分钟，取出玻片，自然干燥。
４、 酶染
用1mlPBS溶解一支冻干猪瘟标抗体制剂 ，在玻片左边的触（涂）面上滴加2滴猪瘟酶标抗体液并涂开，使其覆盖触（涂）面，右边用PBS覆盖作对照，将玻片平放在玻片上，置37℃45分钟，取出玻片，流动的PBS洗15分钟。
５、 显色
取底物液100ml于放有检样玻片染缸中，置室温。避光，30分钟。取出玻片，流动的去离子水洗15分钟，使其干燥。
６、 镜检
若左边触（涂）面中细胞 浆呈棕黄色，细胞核无色，右边对照不显色者，则为阳性；否则为阴性。
７、 认真观察病变。
II免疫荧光试验
一、 目的
掌握免疫荧光试验的方法及原理。
二、 实验步骤
１、 制片、固定同前法。
２、 加染荧光抗体
在玻片左边的触（涂）面上滴2滴猪瘟荧光抗体液并涂开，右边用PBS作对照，将玻片平放在玻片架上，置37℃45分钟，其后PHS（PH7。4；0。01M）洗15分钟。
３、 晾干玻片后，镜检。若左边触（涂）面中细胞浆呈特异性黄绿色荧光，右边对照不呈色者，则为阳性；否则为阴性。
III、示教实验
１、 ELISA试验检测猪瘟抗；
２、 猪瘟病毒单克隆抗体的诊断应用；
３、 感染猪瘟病毒PK…15细胞的IIF。
IV思考题
１、 为什么要对触（涂）片进行固定？
２、 为什么要灭活内源酶？机理是什么？
３、 免疫酶组化法和常规ELISA有何异同点？优缺点是什么？
４、 诊断猪瘟还可用哪些方法？
实验五 鸡新城疫的诊断
I、 鸡新疫病毒的鸡胚分离
一、 目的
掌握利用鸡胚分离病料中的NDV；
熟悉鸡胚接种方法。
二、 实验器材
碘酒棉球、酒精棉球 锥子 蛋架 10ml灭菌管 1ml 、5ml吸管 玻璃研磨器 1ml注射器 5号针头 9…10龄鸡胚 生理盐水
青霉素双抗液（1万iu/ml） 离心机 天平 剪刀 镊子 玻璃
铅笔 ND病死鸡 透明胶布 照蛋器
三、 实验动物的准备
将NDV强毒做1：100稀释注射健康的NDV易感小鸡（1月龄左右），0。2ml/只胸肌注射；小鸡将在注射后48小时左右死亡。死亡鸡尽快进行实验。
亦可从ND自然病鸡分离病毒。
四、 实验步骤
１、 无菌操作，沿死鸡颅腔边剪开颅骨，用镊子除去头盖骨，使脑髓暴露。
２、 取约1g（蚕豆大小）脑髓置玻璃磨器内，并加少量生理盐水，磨碎，再补加生理盐水使总量约为5ml。然后加入双抗液0。5ml（最终浓度达1000iu/ml），置37℃作用20分钟，离心，2000转/分，15分钟。
３、 取上清液接种鸡胚尿囊腔
（1） 照蛋。在靠近气室的下方，避开大血管，用玻璃铅笔标记接种点。
（2） 消毒。打孔。
（3） 接种：将针头以与蛋壳成30（度）角的方向刺入尿囊腔，向尿囊腔内接种经步骤2处理的病料上清液0。1ml；注射速度宜慢。
（4） 用透明胶布封口。
４、 接种24小时开始照蛋，每天上、下午各照一次，弃去24小时内死亡的鸡胚，24小时以后死亡的鸡胚，置铁篓中，大头朝上，置4…8℃备做HA、HI试验。
５、 观察死亡鸡的病变并做记录。
II、 免疫荧光试验
一、 目的
了解免疫技术的一般程序和荧光抗体的制备；
掌握利用抗NDV单克隆抗体和间接免疫荧光技术诊断ND的方法。
二、 实验器材
抗NDV单抗 兔抗鼠荧光抗体 PH7。2 0。01MPBS 铜蓝 丙酮 蒸馏水 载玻片（洁净无油） 1000ml烧杯 磁棒 磁力搅拌器
滴管 吸水纸 剪刀 外科手术刀 镊子 病死鸡（新鲜）
三、 实验动物的准备
同实验I
四、 实验步骤
１、 无菌操作，解剖鸡。
２、 取脑、肺、脾和盲肠扁桃体，用切面在载玻片上作两个很薄的压印，自然干燥。
３、 压印片置盛有4℃丙酮的染色缸内固定10分钟，取出自然蒸发干燥。
４、 压印片置染色架上，一个压印面上加NDV单抗液数滴覆盖，另一个压印面上加PBS覆盖作对照，染色架置于37℃饱和水汽中（可置于水浴箱中）作用30分钟。
５、 取出载玻片，用去离子水和蒸馏水漂洗后，置铜蓝中，流动PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，取出，吸水纸吸干并充分干燥。
６、 将工作浓度稀释的兔抗鼠荧光抗体加于盖玻片的两个图片上，置37℃水浴作用30分钟。
７、 流动的PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，自然干燥。
８、 镜检
凡组织胞浆内出现兰绿色荧光或荧光颗粒而细胞核无荧光的判为阳性，否则为阴性。
Ⅲ、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
一、 目的
了解和HA和HI试验并用于诊断ND
二、 实验器材
蛋架 镊子 滴管 10ml试管 微量血凝板 磨平滴管 生理盐水 振荡器 大平皿 1ml吸管 试管架 碘酒棉球 1％鸡红血球 NDV阳性抗血清 搪瓷盘 疑似ND病料接种致死的鸡胚（见实验I）
三、 实验步骤
（一） HA、HI试验
１、 无菌操作，收获鸡胚尿囊腔液。
２、 作HA试验，测出血凝价。
３、 作HI试验，测出血凝抑制价。
４、 观察鸡胚病变，并做记录。
HA试验操作方法表解如下：
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1：10 2：10 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
试 生理盐水
1：5稀释尿囊液
液 0。5％鸡红血球 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
弃 0。5
0。5
混匀；置室温20…30分钟观察结果
结果举例 # # # # # # ＋＋
表1所 示HA价为1：320
表2 HA…微量法（单位：滴）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256 1：512 1：1024 1：2048 对照
生理盐水 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
尿囊原液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0。5％鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温20…30分钟；观察结果
结果举例 # # # # # # # # # # # #
表2所示HA价为1：256
表3 HI…试管法（单位：ml）
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
尿囊液 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 弃0。5
1：5稀释的抗NDV血清 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
混匀；置室温30分钟
0。5％鸡红血球 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
混匀置室温20…30分钟观察结果
结果举例 … … … … … ＋ ＋＋ # …
表3所示HI价为1：160
表4 HI…微量法（单位：滴）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256 1：512 1：1024 1：2048 对照
尿囊液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 弃1
抗NDV血清 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温30分钟观察结果
0。5％鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温20…30分钟
结果举例 … … … … … … … ＋ ＋＋ ＋＋＋ # …
表4所示HI价为1：128
注：若HA价是1：320；则0。5ml1：160稀释的尿囊液中含2iu病毒，0。5ml1：80稀释的尿囊液中含4iu病毒；0。5ml1：40稀释的尿囊液中含8iu病毒。
HI试验用搞原直接稀释血清法；表3和表4中；第1管（孔）用0。5ml含水8个iu病毒的尿囊液；第2—4管（或2—12孔）用0。5ml含4个iu病毒的尿囊液。
四、思考题
１、 什么叫血凝价（HA价）？什么叫血凝单位？什么叫血凝抑制价？
２、 为什么诊断ND要做HI 试验？
３、 HA和HI试验在家畜传染病学上应用有哪些？
４、 为什么NDV具有自动解凝现象？解凝后的红细胞能否再被NDV凝集？
５、 如何判定HA和HI试验结果？
IV、 示教试验
１、 NDV单抗分型试验（IIF）？
２、 单抗夹心ELISA试验检测NDV。
实验六 鸡马立克病的琼扩诊断
一、 目的
掌握琼脂板的制作方法和利用双向琼扩试验诊断ND。
二、 实验器材
干净大平皿 打孔器 打孔图纸 16号针头 7号针头 磨平针头
剪刀 镊子 试管 架 搪瓷盘 天平 铝锅 电炉 玻棒
10ml吸管 毛细滴管 滴头 红铅笔 橡皮膏 湿盒 阳性羽根
琼脂粉 氯化钠 量管 蒸馏水 示教平板
三、 实验步骤
（一） 琼 脂板制备
１、 称取琼脂粉4g，NaCL 400g铝锅内加蒸馏水500ml，煮沸溶化。
２、 浇琼脂板，每只直径90mm平皿倾注溶化的0。8％琼脂液18—20ml；然后将平皿置于水平的桌面上；使其自然凝固成厚度均匀的琼脂平板。
３、 按试验的需要打孔，烫孔。
（二） 羽根琼扩试验
１、 按打孔图纸所示模式打孔，烫 孔。
２、 每只受检鸡拔取6根新羽（最好是羽根带血的新羽），剪下羽根，长约0。5ｃｍ。
３、 在孔内加抗MD阳性血清。
４、 距血清孔内约3mm的四周上均匀六点垂直插入同一只鸡的六根羽根，并做阳性羽根对照。在平皿壁上标记受检的号码。
５、 平皿置湿盒中，于37℃进行扩散。
６、 24小时后观察结果，同一只鸡的六根羽根只要有一根与抗MD阳性血清孔间出现沉淀即可判定为MD阳性鸡。
（三） 血清琼扩和羽根浸液琼扩试验
１、 受检鸡血清分离
以带20号针头的1ml玻璃注射器从鸡翅静脉采血约0。5ml注入灭菌试管，也可以刺破静脉后，将一灭菌试管靠近流血处使血流流入试管约0。5ml，将试管摆成斜面，待血凝固，血清析出，供实验用。
２、 羽根浸液的制备
将受检鸡新生羽根10条放在小试管内，加生理盐水约0。5ml，用玻璃棒轻压羽根，使囊内的MDV浸出，上清液供实验用。
３、 按打孔图纸模式打孔、烫 孔，共九个区。
４、 实验程序
（1） 血清琼扩
将MD诊断抗原液加入中间孔，受检鸡血清加入周围孔，每个检样用一孔，并设抗MD 阳性血清对照，每区最接近平皿壁的孔定为第1孔，由此按顺时针方向定为2、3、4、5、6孔，在记录本上记下与孔号相对应的鸡号。
（2） 羽根浸液琼扩
将MD阳性血清加入中间孔，受检羽根浸液加周围孔，每个检样用一孔，并设阳性MD 抗原对照，�
