实验室手册-第13章
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一、试剂配制：
1、 DMEM＋10％FCS
2、肝素2000U/ml
（4万单位溶于20mlPBS，过滤除菌；使用时0。1ml肝素＋10ml血）
3 无Ca＋＋、Mg＋＋，PBS，灭菌
4、0。2％台盼蓝
5、PHA80ug/ml
0。8mgPHA＋无菌10mlDMEM＋10％FCS中；
6、H—THYMIDINE
1mCi/ml的液体0。5ml___溶于50mlDMEM＋FCS液中；终浓度为1uci/100ul。
7、消化液20ml
浓甲酸 15ml
H2O2（30％） 5ml
8、液闪液（所有器皿需烘干）
PPO 5g
POPOP 2。5g
溶于200ml无水乙醇＋800ml甲苯；摇匀；
9、MTT
二、外周血淋巴细胞PBM制备
1、 10ml肝素抗凝血；
2、 50g，4℃10—15min；
3、 收集上层液体；
4、 用DMEM＋10％BFS洗一次；
400g 4℃ 10min；
5、 吸弃上清，加5mlDMEM＋10％BFS；
6、 活细胞计数（方法见前）
调整细胞浓度至2X107/ml
三、同位素法测定转化后的细胞活性
1、按下列方式分别加入淋巴细胞悬液和PHA：
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
（1） 淋巴细胞浓度2X107/ml，每孔加入0。5ml；终浓度为1X107/ml；
（2） PHA浓度80 40 20 10 5 0ug/ml；每孔加入0。5ml；终浓度为40 20 10 5 2。5 0；
2、 37度CO2箱内培养56h；
3、 A、B两排每孔加1uci、’H…thymidine；
4、 继续培养16小时；
5、 收集A、B、C排细胞于离心管内；
6、 400g10min，弃上清；
7、 A、B排细胞沉淀用PBS洗一次，400g×10min；
8、 放射性测定；
（1）A、B离心馆开盖80度烘干，2…3小时；
（2） 每管内加消化液200ul；
（3） 盖好，90度水浴1小时；
（4） 每管取100ul置液闪瓶内；
（5） 每瓶加4ul闪烁液
（6） 液闪仪测定
刺激指数SI= 加PHA管的CPM均值
——————————————
对照管CPM均值
四、形态学方法：
1、 C排管内细胞沉淀物涂片
2、 GIEMSA——WRIGTH染色
3、 镜检
200个LC；计算转化率
转化率（％）=转化LC/淋巴细胞总数
五、 MTT法
MTT法是一种四甲基偶氮唑盐＇3—（4。5… dimethyl__thlazd…2…yl）…2。5…diphenyl…terrazolium bromide＇淡黄色，易溶液于水，MTT经活细胞线粒体中的脱氢酶作用后可氧化成蓝色结晶甲遥滓｛经异丙醇作用后溶解显色，此法简易，准确且无同位素污染，以此法代替H’—TDR掺入法可进行细胞代谢活性及增殖反应的测定。
1、 不同处理的细胞加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，37℃6％CO2培养。
2、 培养结束前4小时加入100ul/孔MTT试剂。
3、 培养结束后，取出培养板，4℃下1500r/m离心7分钟，甩去上清。
4、 立即加入10％盐酸一异丙醇，100ul/孔，充分吹吸混匀。
5、 于DG一3022型酶联免疫仪上测定OD570nm、OD650nm，求出OD550值。
第十二章 动物实验的一般规则
一、 依据实验目的要求，如病毒LD50、LD100、ID50等、细菌毒力测定、免疫效力试验、免疫血清制备等，选择不同种类、品系及不同饲养管理条件下的实验动物式实验用动物。常用的实验（用）动物包括小白鼠、大白鼠、豚鼠、绵羊、山羊、小香猪、他猪八戒、家兔、鸡、鸭、鹅等十几种。其中部分动物又有自然繁殖、近交系等、SPF与非SPF等区分。
二、依据动物骒病原体的敏感性或骒接种物的应答性不同，确定选用动物的年龄、性别，特别是使用动物的数量。
四、 不同实验研究类型所要求的动物数量不相同，现简述如下：
（一） 现况研究（Cross…sectional study）的一般样本大小可用下列公式计算：
S．E．=PQ/N
S．E．=标准误，P=某病的现患率或感染率，Q=1…P，N为样本大小。根据上述公式，可得到下列简便公式。
1、 若容许误差d=0。10P；95％可信水平t=2样本的感染率P与总体感染P之间有差异d。P…p=＋（…）d=＋（…）txS。E；S。E。=d/t。0。05水平；自由度为无限大时；t值约为2。
P。Q P。Q t（2）PQ
N=———— =—————— =——————
（S。E。）（2） （d/t）（2） d（2）
令d=0。1P
2（）PQ 4PQ Q
N=———————— =———————— =400X——
（0。1P）（） 0。02P（） P
2、 若容许误差d=0。15P；则
Q
N=178X——
P
3、 若容许误差d=0。20P；则
N=100XQ/P
4、 抽样调查肿瘤或其它发病率很低的疾病时，样本大小可参考Poisson分布期望可信限表。
（二） 病例对照研究（case…control study），又称回顾性研究（retrospective studies），研究样本大小可按下列分式计算。
N=————————————
Ka与Kb分别为a与b时正态分位数。可以队表中查得。
P1和P2分别为估计 对照组与病例组有暴露史的比例。
Q1=1…P1， Q2=1…P2
P=（P1＋P2）/2，Q=1…P
另，病例的暴露史可用下列公式估计：
P2=（ORXP1）/（1…P1＋ORXP1）
OR为比值比。
附表 正态分布的分位数表
KA（ 单侧检验）
KC（单侧和双侧检验） Kb（双侧检验）
3。090
2。878
2。576
2。326
2。058
1。960
1。645
1。282 3。290
3。090
2。807
2。576
2。326
2。242
1。960
1。645
（三） 队列研究（cohort study）；又称前瞻性研究（prospective studies）。研究样本大小可用下列公式计算：
但这里P1为暴露组的发病率，P0为非暴露组的发病率。
Q1=1…P0 ， Q0=1…P0
P=（P0＋P1）/2， Q=1…P
如已知P0与估计某相对危险度（R），则
P1=RP0
（四） 实验研究
1、 对于发病率在5％以上的疾病作实验研究时，两组需要的动物数（N1及N2）可用下列公式计算：
可信限为95％。T值为1。96按2计算。式中P1为对照组的预期发病率，q1=1…p1；p2为实验组的预期发病率， q2=1…p2；N1为对照组需要的观察数。
设N1=N2，上式中仅N为未知，将p、q值分别代入公式即可得N值。
2、 对于发病率在5％以下，尤其是在1％以下的低发病率疾病的调查研究时，常采用泊松分布来推导样本数。
四、试验动物数的多少，除用上述公式计算和查表外，还应考虑以下几个因素：
1、 疾病的罹患率高低。
2、 实验措施有效率的高低。
3、 要求实验精确度的高低。
4、 要求实验组和对照组差异显著性的程度。
5、 两组的均衡性即齐同必的好坏。
6、 实验分组越多，则样本世纪数就需要增长率大。
五、 实验动物的分组必须考虑各组中动物的齐同性、随机性、重复性等，尽量减少实验田的偏差。实验动物的随机性分组方法详细参阅有关书籍，常见方法有完全随机设计、配对设计、随机单位组设计和拉丁方法设计和正交设计等。
六、 实验中必须设立严格合理的对照。通过对照组可取得研究指标的数据差异、清除被试因素以外的其它因素对结果的影响等。
七、 使用实验动物务必记住节约二字，需要什么样的动物园就使用什么样的动物园，不要越级使用。在周密的设计和论证的基础上，再提出实验田动物的订购计划。
八、 正式实验之前的充分准备工作可以起到事半功倍的效果，通常预试期可以达到下列目的：
1、 使试验动物园习惯于试验期的环境条件。
2、 做好试验动物的长势、驱虫、防疫注射等项准备工作以及对它们的健康观察。
3、 训练试验人员，熟练掌握操作规程。
4、 考核试验设计是否恰当和切实可行，发现部题及时纠正。
5、 通过预试期得到统计数据，对试验动物进一步审查、调整。一般要求预试期试验动物园头数应多于正式试验的头数；预试期的长短可因试验要求而定，一般为15——20天。
九、 实验结果必须进行统计分析。
十、 几个使用动物园进行实验的范例
1、 Z4＋HVT二价活苗的实验室免疫效力试验；
2、 Z4保护力及其致瘤性测定；
3、 应用粘附素单抗治疗仔猪下痢的研究；
4、 免疫血清的制备；
5、 病毒常规毒力指标测定（包括使用鸡鸭鹅胚）；
6、 细菌毒力测定等。
第十三章 电泳技术、层析技术
有关电泳技术、层析技术已分别在前面各章节中讨论，这里不再单独赘述。对于刚开始实验工作的人员请详细参阅：
1、 Mononlonal Antibodies：Principle and Practice James W。Goding
2、 生化实验技术与原理
隋德新
单克隆抗体：原理、方法及应用
刘秀梵
第四部分 家畜传染病学实验指导
目录
家蓄传染病学实验规则
附 学生实验守则
家蓄传染病实验报告内容
实验一 碳疽的诊断
实验二 巴氏杆菌病的诊断
实验三 结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
实验四 猪瘟的诊断
实验五 鸡新城疫的诊断
Ⅰ、鸡新城疫病毒的鸡胚分离
Ⅱ、免疫荧光实验
Ⅲ、HA和HI试验
实验六 鸡马立克氏病的琼扩诊断
实验七 沙门氏菌快速检验试验
实验八 鸡白痢的检疫
家蓄传染病学实验规则
1、 实验前必须穿好工作服，实验后必须认真洗手后方可离开实验室。
2、 实验室禁止饮食、吸烟，勿以手指、器械等与面部接触，以防感染 。
3、 操作时务须聚精会神，严肃认真，不得顾盼言他。
4、 污染的器皿及废弃病料、污水等均应严格按规定处理。
5、 菌种、毒种不得擅自带出实验室。
6、 爱惜实验器械，若有损坏应主动登记、报告。
7、 保持实验室安静、整洁。
8、 实验后，必须关好水电，清洗整理好本小组物品。
9、 每次实验完毕，值日生应认真预习，熟悉实验内容，实验完毕应以科学态度写出实验报告。
附一 学生实验手则
1、 实验前应认真预习，经教师质疑不合格者不得进行实验。
2、 服从教师指导，按规定和步骤进行实验，认真地观察和分析实验对象，如实地记录实验数据，不得抄袭他人实验结果。
3、 要注意安全，爱护实验用具和设备，节约水、电、气和实验材料等。
4、 进入实验室或实验场地，必须衣着整齐，保持安静，严禁谈笑喧哗、抽烟、随地吐痰，更不得动用与本实验无关的其他仪器设备或教学标本等。
5、 认真作好实验报告，凡不合格要求者，均须重做。
6、 实验完成后，主动整理好实验用具，关好水、电、气流，搞好清洁卫生。
7、 凡违反实验规程或擅自动用其它实验用具、设备而导致损失者，必须写出书面检查，并按�
